吲哚乙酸氧化酶活性测定试剂盒说明书
微量法 100T/96S
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
吲哚乙酸（IAA）在吲哚乙酸氧化酶的作用下，被氧化破坏失去活性。植物体内吲哚乙酸氧化酶活力的大小，对调节体内吲哚乙酸的水平，起着重要的作用，而影响植物的生长。
测定原理：
在无机酸存在情况下，吲哚乙酸能与FeCl3作用，生成红色螯合物，该物质在530nm处有最大吸收峰，酶活力的大小可以其破坏吲哚乙酸的速度表示之。吲哚乙酸的含量可用比色法测定。
自备仪器和用品：
低温离心机、水浴锅、可调节移液器、可见分光光度计/酶标仪、1.5mL离心管、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：液体120mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体10mL×1瓶，4℃保存。
试剂三：液体10mL×1瓶，4℃保存。
试剂四：液体10mL×1瓶，4℃保存。
试剂五：液体2mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂六：液体50mL×1瓶，4℃保存。临用前吸取1mL试剂五加入试剂六中混匀，待用，避光保存
粗酶液提取：
测定操作：
1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到530 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂二、试剂三、试剂四置于25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）水浴中保温20min。
3. 取1.5mL EP管若干，按操作依次加入试剂，操作表如下：
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标准管 |
测定管 |
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试剂二（μL） |
20 |
20 |
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试剂三（μL） |
20 |
20 |
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试剂四（μL） |
40 |
40 |
|
样本上清液（μL） |
0 |
20 |
|
试剂一（μL） |
120 |
100 |
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充分混匀后置于30°恒温水浴中，保温反应30min。 |
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实际六（μL） |
400 |
400 |
|
充分混匀，置于30℃黑暗水浴保温显色30min。取200μL显色后呈红色的反应液于微量玻璃比色皿/96孔板中，用分光光度计或酶标仪中测定波长530nm处OD值，标准管记为A1，测定管记为A2 |
||
注意：标准管只需做一次
IAA氧化酶活性计算公式：
IAA标准曲线公式：y = 1.334x + 0.025 R2 = 0.998 （x为IAA浓度，mmol /L；y为吸光值）
酶活定义：从开始时加入的IAA量减去酶作用后残留的IAA含量，即得被酶所催化的IAA含量。以每mg酶蛋白在1h内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。
U（μmol/h/mg prot）=[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V样÷（V样×Cpr）÷T
=1.5×（A1-A2）÷Cpr
酶活定义：以每g样本在1h内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。
U（μmol/h/g 鲜重）=[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V样÷(V样÷V样总×W) ÷T
=1.5×（A1-A2）÷W
酶活定义：以每1万个细胞在1h内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。
U（μmol/h/104 cell）=[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V样÷(V样÷V样总×W) ÷T
=1.5×（A1-A2）÷细胞数量
酶活定义：以每mL酶液在1h内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。
U（μmol/h/mL）=[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V样÷(V样÷V样总) ÷T
=1.5×（A1-A2）
V样总：上清液总体积，1mL；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g，T：反应时间，0.5h。
b.使用96孔板测定的计算公式如下
IAA标准曲线公式：y = 0.667x + 0.025 R2 = 0.998 （x为IAA浓度，mmol /L；y为吸光值）
（1）按蛋白浓度计算
酶活定义：从开始时加入的IAA量减去酶作用后残留的IAA含量，即得被酶所催化的IAA含量。以每mg酶蛋白在1h内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。
U（μmol/h/mg prot）=[(A1-0.025) ÷0.667-(A2-0.025) ÷0.667] ×V样÷（V样×Cpr）÷T
=3×（A1-A2）÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
酶活定义：以每g样本在1h内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。
U（μmol/h/g 鲜重）=[(A1-0.025) ÷0.667-(A2-0.025) ÷0.667] ×V样÷(V样÷V样总×W) ÷T
=3×（A1-A2）÷W
（3）按细胞数量计算
酶活定义：以每1万个细胞在1h内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。
U（μmol/h/104 cell）=[(A1-0.025) ÷0.667-(A2-0.025) ÷0.667] ×V样÷(V样÷V样总×W) ÷T
=3×（A1-A2）÷细胞数量
（4）按液体体积计算
酶活定义：以每mL酶液在1h内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。
U（μmol/h/mL）=[(A1-0.025) ÷0.667-(A2-0.025) ÷0.667] ×V样÷(V样÷V样总) ÷T
=3×（A1-A2）
V样总：上清液总体积，1mL；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g，T：反应时间，0.5h。
注意事项：
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资料/datasheet
