果糖-1,6-二磷酸酶(Fructose 1,6-bisphosphatase，FBP)试剂盒说明书
微量法 100管/96样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义
果糖-1,6二磷酸酶又称果糖1,6二磷酸酯酶，催化1,6二磷酸果糖和水生成6磷酸果糖和无机磷，在糖的异生代谢和光合作用同化物蔗糖的合成中起关键性的作用。
测定原理
FBP催化1,6二磷酸果糖和水生成6磷酸果糖和无机磷，在反应体系中添加的磷酸葡萄糖异构酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH，340nm下测定NADPH增加速率，即可计算FBP活性。
需自备的仪器和用品
分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制
提取液一：液体100mL×1瓶，4℃保存。
提取液二：液体100mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前加入20mL试剂四充分溶解待用，用不完的试剂4℃保存；
试剂二：液体7.2μL×1支，4℃保存；临用前加入1mL蒸馏水充分溶解待用，用不完的试剂4℃保存；
试剂三：粉剂×1支，-20℃保存；临用前加入1mL蒸馏水充分溶解待用，用不完的试剂4℃保存；
试剂四：液体25mL×1瓶， 4℃保存；
样本的前处理
①总FBP酶提取：建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液一，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，8000g离心10min，取上清测定。
②胞浆和叶绿体FBP酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5～10的比例（建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液一），冰浴匀浆后于4℃，200g离心5min，弃沉淀，取上清在4℃，8000g离心10min，取上清用于测定胞浆FBP酶活性，取沉淀加1mL提取液二，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，8000g离心10min，取上清测定叶绿体中FBP酶活性。
建议测定总FBP酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的FBP，则按照步骤②提取粗酶液。
测定步骤
|
试剂名称（μL） |
测定管 |
|
样本 |
20 |
|
试剂二 |
10 |
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试剂三 |
10 |
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试剂一 |
160 |
将上述试剂按顺序加入微量石英比色皿或96孔板中，立即混匀，加入最后一个试剂的同时开始计时，在340 nm波长下记录反应1min后吸光度A1和反应6min后的吸光度A2，计算ΔA=A2-A1。
FBP活性计算
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
FBP（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=321.5×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟生成1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
FBP（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V样÷V样总) ÷T=321.5×ΔA÷W
V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.02 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。
b.用96孔板测定的计算公式如下
（1）按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
FBP（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟生成1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
FBP（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V样÷V样总) ÷T=643×ΔA÷W
V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。
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资料/datasheet
