【产品名称】
通用名称：嗜肺巴斯德杆菌探针法 qPCR 试剂盒
【产品编号】AP9696
【包装规格】50T/盒
【预期用途】
产品就是以探针法 qPCR 技术为基础开发的专门检测嗜肺巴斯德杆菌的试
剂盒 。
【检验原理】
嗜肺巴斯德杆菌(Pasteurella pneumophila)在自然界中分布广泛，它有两
种生物型，主要感染啮齿类动物，对实验小鼠、大鼠和豚鼠的危害较大。嗜肺巴斯德
杆菌作为一种条件致病菌，能够引起免疫缺陷动物或免疫功能低下的动物产生严重的
肺炎，并可能导致动物死亡。
本试剂盒根据探针法荧光定量 PCR 原理开发的嗜肺巴斯德杆菌检测试剂
盒。本产品即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。引物等组分经过优化，灵敏
度高。提供阳性对照，便于区分假阴性样品。特异性高，引物是根据嗜肺巴斯德杆菌
DNA 序列高度保守区设计，不会跟其他病毒的 DNA 发生交叉反应。既可用于定性
检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为 5 个数量级。本产品足
够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。本产品只能用于科研。
【试剂组成】
说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
【运输及保存】
低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。
【自备试剂】
样品 DNA。
【适用仪器】
ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系
列荧光定量 PCR 检测仪。
【使用方法】
1. 试剂准备（试剂准备区）
稀释标准曲线样品（以 10E1-10E6 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。
由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污
染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品
不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管，分别为 6，5，4，3，2，1。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同。
3. 在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1 分
钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充
分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在 4 号管中加入 5 μL 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充
分震荡 1 分钟，得 1×10E4 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
2. 样本处理（样本处理区）
2.1 如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对
照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 上步所得 4 号稀释液再加上
一定量的水使总体积跟核酸制备试剂盒所要求的起始样本体积一样，以此作为 PC。
另外用水作为 NC。
2.2 核酸提取：核酸提取可以采用上海抚生实业有限公司的核酸提取或纯化试剂，操
作方法按照说明书进行。
3.试剂配制(试剂准备区)
准备足量的 PCR 管(样品管、阴性对照管、阳性对照管)，向各 qPCR 管中分别
加入下列成分：
4.添加模板(模板添加区)
向 qPCR 管中分别加入 5 uL 模板，顺序为阴性对照（DEPC-H2O）、待测样
品模板、嗜肺巴斯德杆菌 qPCR 阳性对照，离心 30 秒，立即进行扩增反应
5.扩增反应(扩增及产物分析区)：
将 qPCR 管放置在 qPCR 扩增仪器样品槽相应位置，进行扩增，扩增程序如下
【结果判定】
1. 如果制作标准曲线，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制
标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，
推算出其浓度。
2. 如果未制作标准曲线，按照如下标准判定结果：
阳性对照（1×10E5 拷贝/μL）结果：Ct 值<30，有明显指数增长，呈典型的 S 型
曲线。阴性对照结果：Ct 值>40 或无 Ct 值，无明显指数增长期和平台期。样本检
测结果：Ct 值<38，有明显指数增长，表明样本中检测出嗜肺巴斯德杆菌，结果为
阳性；Ct 值>40 或无 Ct 值，表明样本中未检测出嗜肺巴斯德杆菌，结果为阴性；
Ct 值在 38-40 范围，应对样本进行复检，如重复实验结果 Ct 值仍在 38-40 范围，
有明显指数增长，则判定为阳性，否则为阴性。
【注意事项】
1．PCR 操作各阶段应严格分区操作，避免交叉污染。
2．试剂盒各组分使用前应充分融化混匀，离心数秒后使用。
3．各组分不得与其他产品或不同批号的相应成分进行互换。
4．待测标本若不及时检测，应保存于-20℃或-70℃。
5．样品的处理应该严格按照生物安全规范操作。
6．PCR 操作人员应具有经验和受过专业培训。
7．本试剂盒仅用于科研使用，不做为临床诊断使用。
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资料/datasheet
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