公司产品仅供科研研究使用、不得用于临床诊断!
商品属性:
产品名称
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规格
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货号
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T4 UvsX Recombinase
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3 mg
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A-PJ1165
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T4 UvsX Recombinase
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300 μg
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A-PJ1165
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描述:
UvsX 重组酶,来源于 T4 噬菌体,是 RecA/Rad51家族的同源体。RecA/Rad51 重组酶家族在双链 DNA 断裂的无误修复和复制叉重新启动的过程中起到重要作用。
T4 UvsX 重组酶可与其他重组酶一起锚定在单链 DNA 上并激活其在其他双链 DNA 上寻找同源序列,以进一步完成链置换。经检测,该酶无核酸酶活性。
![](/usr/uploads/3/202309/T4 UvsX Recombinase.png)
储存:
置于-20°C 可保存 1 年,-80°C 长期保存,短期使用置于 4°C,保存一个月,避免反复冻融。
热失活:60°C,10min。
酶储存液:50 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1 mM
EDTA, 10% Trehalose, pH 7.5。2xRPA BufferMix:包含反应缓冲盐、ATP、磷酸肌酸、dNTP、PEG、DTT、BSA 等,可用于 RPA 扩增试验。该试剂 4°C
条件下放置 1 个月性能无下降。
基于本蛋白进行 RPA 反应测试的全套试剂
![](/usr/uploads/3/202309/T4 UvsX Recombinase3.png)
用于 RPA 扩增的测试引物与探针
CPV-F(20uM) CACTTACTAAGAACAGGTGATGAATTTGCTACAG
CPV-R(20uM) AGTTTGTATTTCCCATTTGAGTTACACCACGTCT
Probe(10uM) CCTCAAGCTGAAGGAGGTACTAACTTTGGT[dT-BHQ1]
[THF][dT-FAM]ATAGGAGTTCAACAAG -(C3)
Canine parvovirus type 2,VP2
加入 1μl 的模板 DNA,上机反应前加入 1.25 μl 的 280 mMMg(OAC)2(终浓度 14 mM),总反应体积 25 μl。混合均匀,并离心,置于 39-42℃条件下反应 30min。
2. 进行荧光 RPA 扩增在进行荧光检测时体系中,额外加入 0.3 μl 的 10μM Probe(120 nM的终浓度)和 50U 的 Exonuclease III(2U/μl 的终浓度),即可进行荧光检测。本方法应用原理为 ExoIII 切割 THF 位点,使荧光与猝灭基团分离,报告荧光信号。
特别说明:
(1) 以上 RPA 扩增测试属于蛋白功能性测试,按照以上实验操作流程,可获得 RPA 扩增产物。进一步的优化,包括:X、Y、GP32、聚合酶、反应 Buffer,甚至加样顺序,均可能进一步提高 RPA 的扩增性能。
(2)关于 DNA 聚合酶的选择, 测试了三种常见的 DNA聚合酶,在进行荧光法测定时,推荐的选择顺序依次为 Bst 4.0>Bsu> Sau,且在 42℃条件下,总能获得最快的扩增速度,且荧光信号更强。在 Basic 扩增中 Sau 表现出特异性扩增能力更佳。
(3)关于 RPA 的灵敏度与非特异扩增,在 Basic 试剂的扩增中,仍然存在非特异扩增产物,这需要进一步优化反应组分及引物序列。在使用荧光探针法时,但由于特异性探针的存在,非特异扩增产物通常无荧光信号值,但此时会影响检测灵敏度。GP32 蛋白的
浓度增加会显著降低非特异性扩增,但会导致扩增速度减缓,此时需要同步增加 X 与 Y 蛋白的用量,以维持 RPA 的扩增速度。
(4)据文献报道,在进行试纸条 RPA 实验时,倾向使用 Nfo 内切酶又名 Endonuclease IV, 来对扩增探针进行切割,但 未予测试,目前无法提供相应参数。
(5)RPA 反应 Buffer 对扩增至关重要,轻微的浓度差异,均可导致扩增效率大幅下降,甚至失败。RPA BufferMix 为粘稠试剂,使用时务必保证加样准确,Tip 头中的残液务必完全打入 EP 管中。