糖原磷酸化酶b（Glycogen phosphorylase b，GPb）试剂盒说明书
微量法 100管/48样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
糖原磷酸化酶（Glycogen phosphorylase，GP，EC 2.4.1.1)）是糖原分解代谢的关键酶，使糖原分子从非还原端逐个断开α-1，4-糖苷键移去葡萄糖基，释放1-磷酸葡萄糖，直至临近糖原分子α-1，6-糖苷键分支点前4个葡萄糖基处。GP分为有活性的糖原磷酸化酶a（GPa）和无活性的糖原磷酸化酶b（GPb）两种形式。GPb在一定浓度的腺苷酸（5，-AMP）存在下可被激活。
测定原理：
GP催化糖原和无机磷产生葡萄糖残基生成糖原和1-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步依次催化NADP还原生成NADPH，在340nm下测定NADPH上升速率，即可反映GP活性。添加一定浓度的腺苷酸（5，-AMP）时测定GP（GPa和GPb）活性，未添加腺苷酸（5，-AMP）时测定GPa活性，GP活性－GPa活性得到GPb活性。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：100mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：液体16 mL×1瓶， 4℃保存；
试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存；
试剂三：粉剂×1支，-20℃保存；
试剂四：粉剂×1支， -20℃保存；
试剂五：粉剂×1支， -20℃保存；
样本的前处理：
按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
注意：由于每个样本需要同时测一个GP（GPa和GPb）活性和一个GPa活性，因此本试剂盒100管测48个样本。
GPb活性计算：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
（1）按样本蛋白浓度计算
单位定义：每mg组织蛋白每分钟产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
GPb（nmol/min/mg prot）＝[(ΔAGP－ΔAGPa)×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=643×(ΔAGP－ΔAGPa)÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
单位定义：每g组织每分钟产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
GPb（nmol/min/g 鲜重）＝[(ΔAGP－ΔAGPa)×V反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=643×(ΔAGP－ΔAGPa)÷W
V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。
b.用96孔板测定的计算公式如下：
（1）按样本蛋白浓度计算
单位定义：每mg组织蛋白每分钟产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
GPb（nmol/min/mg prot）＝[(ΔAGP－ΔAGPa)×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1286×(ΔAGP－ΔAGPa)÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
单位定义：每g组织每分钟产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
GPb（nmol/min/g 鲜重）＝[(ΔAGP－ΔAGPa)×V反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=1286×(ΔAGP－ΔAGPa)÷W
V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。
扫描二维码
扫描二维码
资料/datasheet
