脱氢酶（dehydrogenase, DHA）试剂盒说明书
微量法100管/96样
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
脱氢酶(dehydrogenase, DHA) 是一类催化物质氧化还原反应的酶，催化底物通过细胞色素系统被氧化，释放的能量供机体使用，是生物体取得能量的一种方式。
测定原理
在细胞呼吸过程中，氢受体2, 3, 5 - 氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride, TTC）在脱氢酶作用下接受氢以后，被还原为三苯基甲鐟（Triphenyl Formazone, TF），TF呈现红色，于485nm测定其吸光值，即得脱氢酶活性。
自备实验仪器及用品
筛子、天平、恒温培养箱或水浴锅、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、冰、蒸馏水、甲醇（不允许快递，请用户自备）。
试剂的组成和配制
提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存
试剂一：粉剂×1瓶，使用前加10mL试剂二溶解，4℃避光保存（尽量现配现用）。
试剂二：液体20mL×1瓶，4℃保存。
试剂三：甲醇，自备。
样品处理
测定步骤和操作表
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空白管 |
测定管 |
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样品（μL） |
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100 |
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蒸馏水（μL） |
100 |
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试剂一（μL） |
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100 |
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试剂二（μL） |
100 |
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充分混匀，37℃培养24h |
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试剂三（μL） |
900 |
900 |
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振荡1h，8000g，25℃，离心5min，取200μL上清于微量石英比色皿/96孔板，测定A485，△A=A测定-A空白管。空白管只要做一管。 |
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脱氢酶活力计算
标准曲线：y = 0.0422x - 0.0312；R2 = 0.9988；x为标准品浓度（μg/mL），y为吸光值。
1.按照蛋白浓度计算
酶活单位定义：在37℃时，每mg蛋白样品每min催化产生1μgTF为一个酶活性单位。
DHA（μg/ min / mg prot）=（△A+0.0312）÷ 0.0422×V反总÷（Cpr×V样）÷T= 0.181×（△A+0.0312）÷Cpr
2．按照样本质量计算
酶活单位定义：在37℃时，每克样品每min催化产生1μgTF为一个酶活性单位。
DHA（μg/ min /g 鲜重）=（△A+0.0312）÷ 0.0422×V反总÷（W×V样÷V样总）÷T= 0.181×（△A+0.0312）÷W
3. 按液体体积计算
酶活单位定义：在37℃时，每mL样本每min催化产生1μgTF为一个酶活性单位。
DHA（μg/ min /mL）=（△A+0.0312）÷ 0.0422×V反总÷V样÷T= 0.181×（△A+0.0312）
V反总：反应总体积，1.1mL；V样：加入反应体系中样本体积，0.1mL；T：培养时间，1d=1440min；W：样品质量，g；Cpr：蛋白浓度，mg/mL。
b. 用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y = 0.0211x - 0.0312；R2 = 0.9988；x为标准品浓度（μg/mL），y为吸光值。
1.按照蛋白浓度计算
酶活单位定义：在37℃时，每mg蛋白样品每min催化产生1μgTF为一个酶活性单位。
DHA（μg/ min / mg prot）=（△A+0.0312）÷ 0.0211×V反总÷（Cpr×V样）÷T= 0.362×（△A+0.0312）÷Cpr
2．按照样本质量计算
酶活单位定义：在37℃时，每克样品每min催化产生1μgTF为一个酶活性单位。
DHA（μg/ min /g 鲜重）=（△A+0.0312）÷ 0.0211×V反总÷（W×V样÷V样总）÷T= 0.362×（△A+0.0312）÷W
3. 按液体体积计算
酶活单位定义：在37℃时，每mL样本每min催化产生1μgTF为一个酶活性单位。
DHA（μg/ min /mL）=（△A+0.0312）÷ 0.0211×V反总÷V样÷T= 0.362×（△A+0.0312）
V反总：反应总体积，1.1mL；V样：加入反应体系中样本体积，0.1mL；T：培养时间，1d=1440min；W：样品质量，g；Cpr：蛋白浓度，mg/mL。
注意事项：
配制好的试剂一避光保存于4℃，最好在一周内使用，若出现红色，则不能使用。
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资料/datasheet
