葡萄糖脱氢酶(Glucose dehydrogenase,GCDH)试剂盒说明书
微量法 100管/96样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
GCDH(EC 1.1.1.47)催化D-葡萄糖和NAD(P)生成D-葡萄糖酸和NAD(P)H,大量存在于高等动物的肝脏和弱氧化醋杆菌中。在低聚果糖生产中使用GCDH,不仅能去除低聚果糖中的葡萄糖提高低聚果糖的含量,而且生成的葡萄糖酸与钙离子结合生成的葡萄糖酸钙是一种理
想的补钙制剂。因而,GCDH已成为制备高含量低聚果糖的理想用酶。
测定原理:
GCDH催化D-葡萄糖和NAD生成D-葡萄糖酸和NADH,在340nm下测定NADH上升速率,即可反映GCDH活性。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
提取液:100mL×1瓶,4℃保存;
试剂一:液体19 mL×1瓶, 4℃保存;
试剂二:粉剂×1瓶,-20℃保存;
样本的前处理:
组织的前处理:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
细菌或培养细胞的前处理:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤:
- 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零;
- 工作液的配制:临用前将试剂二转移到试剂一中混合溶解待用;用不完的试剂4℃可保存一周;
- 将工作液置于37℃预热5分钟。
- 在1mL石英比色皿中加入10μL样本和190μL工作液,立即混匀,记录340nm处初始吸光值A1和1min后的吸光值A2,计算ΔA=A2-A1。
GCDH活性计算:
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下:
(1)按样本蛋白浓度计算
单位定义:每mg组织蛋白每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
GCDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=3215×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位定义:每g组织每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
GCDH(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=3215×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
GCDH(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=6.43×ΔA
V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,1 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。
b.用96孔板测定的计算公式如下:
(1)按样本蛋白浓度计算
单位定义:每mg组织蛋白每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
GCDH(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位定义:每g组织每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
GCDH(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=6430×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
GCDH(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=12.86×ΔA
V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光径,0.05cm;V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,1 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。