羟甲基戊二酰辅酶A合成酶（HMGCS）试剂盒说明书
微量法 100管/96样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义
羟甲基戊二酰辅酶A合成酶是甲羟戊酸代谢途径中的关键酶，催化乙酰CoA与乙酰乙酰CoA生成羟甲基戊二酰CoA。
测定原理
HMGCS催化乙酰CoA与乙酰乙酰CoA生成羟甲基戊二酰CoA，同时产生CoASH，使DTNB转化为黄色的TNB，在412nm下有特征吸光值。
所需的仪器和用品
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制
提取液：100mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：粉剂×1瓶，-20℃避光保存；临用前加入3mL蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
试剂二：粉剂×1瓶，-20℃避光保存；临用前加入3mL蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
试剂三：6mL×1瓶，4℃避光保存。
样本测定的准备
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤
HMGCS活性计算
用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、血清（浆）活性
单位定义：每mL血清（浆）每分钟催化产生1nmolTNB为一个酶活力单位。
HMGCS（nmol/min /mL）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样 ÷T=36.76×ΔA
2、组织、细菌或细胞HMGCS活性
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmolTNB为一个酶活力单位。
HMGCS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=36.76×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
单位定义：每g组织每分钟催化产生1nmolTNB为一个酶活力单位。
HMGCS（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（W ×V样÷V样总）÷T=36.76×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算
单位定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmolTNB为一个酶活力单位。
HMGCS（nmol/min /104 cel）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（500×V样÷V样总）÷T=0.074×ΔA
V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：TNB摩尔消光系数，1.36×104 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.1 mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，4 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。
用96孔板测定的计算公式如下
1、血清（浆）活性
单位定义：每mL血清（浆）每分钟催化产生1nmolTNB为一个酶活力单位。
HMGCS（nmol/min /mL）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样 ÷T=73.53×ΔA
2、组织、细菌或细胞HMGCS活性
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmolTNB为一个酶活力单位。
HMGCS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=73.53×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
单位定义：每g组织每分钟催化产生1nmolTNB为一个酶活力单位。
HMGCS（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（W ×V样÷V样总）÷T=73.53×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算
单位定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmolTNB为一个酶活力单位。
HMGCS（nmol/min /104 cel）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（500×V样÷V样总）÷T=0.147×ΔA
V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：TNB摩尔消光系数，1.36×104 L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.1 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，4 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。
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资料/datasheet
