乙酰胆碱酯酶（AchE）活性测定试剂盒说明书
微量法 100T/96S
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
AchE属于丝氨酸水解酶，广泛存在于各种动物组织和血清中。AchE催化乙酰胆碱（Ach）水解，在神经传导调节中起重要作用。
测定原理：
AchE催化Ach水解生成胆碱，胆碱与二硫对硝基苯甲酸（DTNB）作用生成5-巯基-硝基苯甲酸（TNB）；TNB在412nm处有吸收峰，通过测定412 nm吸光度增加速率，计算AchE活性。
自备仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪和蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：液体×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体×1瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂×1支，4℃保存。临用前加入1.3 mL试剂二，充分震荡溶解。
试剂四：粉剂×1支，4℃保存。临用前加入1.3 mL试剂二，充分震荡溶解。
粗酶液提取：
组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，8000g 4℃离心10min，取上清液待测。
细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
血清等液体：直接测定。
测定操作：
2. 试剂二置于37℃水浴中预热30min。
3. 取微量石英比色皿/96孔板，依次加入20μL上清液、160 μL试剂二、10μL试剂三和10μL试剂四，迅速混匀，于412nm处测定3min内吸光值变化，第10s吸光值记为A1，第190s吸光值记为A2。△A测定管=A2-A1。
AchE活性计算：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
组织AchE活性
（1）按照蛋白浓度计算
活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。
AchE酶活(nmol/min/mg prot)= (△A÷ε÷d×V反总×109)÷（Cpr ×V样）÷T
= 245×△A÷Cpr
（2）按照样本质量计算
活性单位定义：每克组织每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。
AchE酶活(nmol/min/g 鲜重)= (△A÷ε÷d×V反总×109)÷（W ×V样÷V样总）÷T
= 245×△A÷W
细菌、细胞AchE活性
活性单位定义：每104个细胞每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。
AchE酶活(nmol/min/104 cell)= (△A÷ε÷d×V反总×109)÷（细胞数量×V样÷V样总）÷T
= 245×△A÷细胞数量
血清AchE活性
活性单位定义：每毫升血清每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。
AchE酶活(nmol/min /mL)= (△A÷ε÷d×V反总×109)÷V样÷T
=245×△A
ε：TNB摩尔消光系数，13.6×103 L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V反总：反应体系总体积（L），200μL=2×10-4L；V样总：提取液体积，1 mL；106：1mol=1×106μmol；Cpr：蛋白浓度（mg/mL）；V样：加入上清液体积（mL），0.02 mL；W ：样品质量；T：反应时间（min），3 min。
b.使用96孔板测定的计算公式如下
（1）按照蛋白浓度计算
活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。
AchE酶活(nmol/min/mg prot)= (△A÷ε÷d×V反总×109)÷（Cpr ×V样）÷T
= 490×△A÷Cpr
（2）按照样本质量计算
活性单位定义：每克组织每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。
AchE酶活(nmol/min/g 鲜重)= (△A÷ε÷d×V反总×109)÷（W ×V样÷V样总）÷T
= 490×△A÷W
活性单位定义：每104个细胞每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。
AchE酶活(nmol/min/104 cell)= (△A÷ε÷d×V反总×109)÷（细胞数量×V样÷V样总）÷T
= 490×△A÷细胞数量
活性单位定义：每毫升血清每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。
AchE酶活(nmol/min /mL)= (△A÷ε÷d×V反总×109)÷V样÷T
=490×△A
ε：TNB摩尔消光系数，13.6×103 L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5 cm；V反总：反应体系总体积（L），200μL=2×10-4L；V样总：提取液体积，1 mL；106：1mol=1×106μmol；Cpr：蛋白浓度（mg/mL）；V样：加入上清液体积（mL），0.02 mL；W ：样品质量；T：反应时间（min），3 min。
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资料/datasheet
