羟脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）试剂盒说明书
微量法100T/96S
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
HYP是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，因此HYP含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。
测定原理：
样品经水解产生游离的HYP，进一步被氯胺T氧化，氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应，产生红色化合物，在560nm处有特征吸收峰。通过测定样品水解液560nm吸光值，可计算HYP含量。
自备实验用品及仪器：
天平、烘箱、玻璃管、离心机、水浴锅、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、无水乙醇、异丙醇、6mol/L盐酸和蒸馏水。
试剂组成和配制：
组织提取液：6mol/L盐酸，自备。浓盐酸：H2O（V/V）= 1:1，室温保存。
细胞提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体6mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂二：液体6mL×1瓶，4℃避光保存。
羟脯氨酸提取：
测定操作表：
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对照管 |
测定管 |
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样本（µL） |
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60 |
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试剂一（µL） |
60 |
60 |
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混匀，室温静置20min |
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试剂二（µL） |
60 |
60 |
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H2O（µL） |
180 |
120 |
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混匀，60℃，20min，取出后25℃静置15 min，取200µL于微量石英比色皿/96孔板中检测560nm处吸光值。ΔA=A测定-A对照 |
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羟脯氨酸含量计算公式：
标准曲线：y=64.875x+ 0.0251，R2=0.9991
（1）按样品重量计算
组织羟脯氨酸含量（mg/g 鲜重）=（ΔA-0.0251）÷64.875×V反总÷(V样÷V样总×W)
= 0.154×（ΔA-0.0251）÷W
（2）按细菌或细胞密度计算
细胞羟脯氨酸含量（mg/104 cell）=（ΔA-0.0251）÷64.875×V反总÷V样×V样总÷细胞数量（万个）= 0.077×（ΔA-0.0251）÷ 细胞数量（万个）
（3）按血清体积计算
HYP含量（mg/mL）=（ΔA-0.0251）÷ 64.875×V反总÷V样×2
=0.154×（ΔA-0.0251）
V反总：反应总体积，0.3 mL；V样：反应中样品体积，0.06mL；V样总：加入提取液体积， mL；W：样本重量，g
b.用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y=32.4375x+ 0.0251，R2=0.9991
（1）按样品重量计算
HYP含量（mg/g 鲜重）=（ΔA-0.0251）÷32.4375×V反总÷(V样÷V样总×W)
= 0.308×（ΔA-0.0251）÷W
（2）按细菌或细胞密度计算
HYP含量（mg/104 cell）=（ΔA-0.0251）÷32.4375×V反总÷V样×V样总÷细胞数量（万个）= 0.154×（ΔA-0.0251）÷细胞数量（万个）
（3）按血清体积计算
HYP含量（mg/mL）=（ΔA-0.0251）÷32.4375×V反总÷V样×2
= 0.308×（ΔA-0.0251）
V反总：反应总体积，0.3 mL；V样：反应中样品体积，0.06mL；V样总：加入提取液体积， mL；W：样本重量，g；2，血清吹干后复溶的倍数。
注意事项：
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资料/datasheet
