尿酸(Uric Acid, UA)含量测定试剂盒说明书
微量法100T/96S
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
UA是鸟类和爬行类动物的主要代谢产物,正常人体尿液中产物主要为尿素,含少量尿酸。此外,UA还是重要的抗氧化剂,能清除超氧化物,羟自由基等。体内UA生成量和排泄量不平衡会导致多种疾病的发生。例如,血中UA升高会引起痛风、肾功能损害和动脉硬化,相反UA降低会引起恶性贫血,在临床诊断上具有重要的意义。
测定原理:
尿酸酶能催化UA生成尿囊素,CO2及H2O2,H2O2 氧化亚铁氰化钾中的Fe2+ 生成Fe3+ ,Fe3+进一步与酚和4-氨基安替比林缩合生成红色醌类化合物,在505nm下有特征吸收峰,测定反应体系505nm的吸收值,可计算尿酸的含量。
自备实验用品及仪器:
恒温水浴锅、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。
试剂组成和配制:
缓冲液:液体20mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:
A:用于标准管和测定管,粉剂1瓶,4℃避光保存,使用前加13mL缓冲液溶解。
B:用于空白管,粉剂1瓶,4℃避光保存,使用前加7 mL缓冲液溶解。
试剂二:粉剂1管,4℃避光保存,使用前加2mL蒸馏水溶解,60℃加热溶解。
样品的制备:
- 动植物组织:建议称取约0.1g组织,加入1mL生理盐水或蒸馏水,进行冰浴匀浆,然后8000g,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
- 血清,培养液:直接检测。
测定操作表:
- 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至505nm。
- 操作表
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标准管
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空白管
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测定管
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试剂一(μL)
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A, 60
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B, 60
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A, 60
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H2O(μL)
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180
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240
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180
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试剂二(μL)
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60
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样品(μL)
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60
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混匀,37℃水浴30min,取200µL于微量石英比色皿/96孔板中,测定505nm处各管吸光值,标准管和空白管只需做一管。
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UV含量计算公式:
1. 组织:
(1)按样本重量计算
尿酸含量(μmol/g 鲜重)=C标准品×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)÷ (W÷V样总)=0.5×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)÷ W
(2)按样本蛋白浓度计算
尿酸含量(μmol/mg prot)=C标准品×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)÷ Cpr =0.5×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)÷Cpr
尿酸(μmol/L)= C标准品×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)×103
=500×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)
C标:标准品浓度0.5μmol/mL;V样总:加入提取液体积,1mL;W:样品质量,g ;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;103 :1μmol/ L=103μmol/ mL
注意事项:
1. 血清样本请在24小时内测定,或者4℃密封避光保存不超过72小时。
2. 吸光值大于0.8可用蒸馏水稀释样本,并在计算公式中算入稀释倍数。
3. 最低检出限为10μmol/L。