乙醇脱氢酶（ADH）活性测定试剂盒说明书
微量法 100T/96S
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
ADH是生物体内短链醇代谢的关键酶，催化乙醇与乙醛可逆转换，在很多生理过程中起着重要作用。哺乳动物ADH主要在肝脏生成，肝脏损伤导致ADH释放到血清中。血清ADH活性高低反映了肝功能是否异常。
测定原理：
ADH催化NADH还原乙醛生成乙醇和NAD+，NADH在340nm处有吸收峰，而NAD+没有；测定340nm 吸光度下降速率，来计算ADH活性。
自备仪器和用品：
研钵、冰、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液器和蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：液体×1瓶，室温保存。
试剂二：液体×1瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂×2瓶，－20℃保存，临用前每瓶加入9mL试剂二，现配现用。
试剂四：液体×1支，4℃保存。
粗酶液提取：
3、血清等液体：直接测定。
ADH测定操作：
1. 分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到340 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂三在25℃水浴中保温30 min。
3. 在微量石英比色皿/96孔板中依次加入20μL样本上清液、160μL试剂三和20μL试剂四，迅速混匀后于340nm测定吸光值变化，分别记录15s和75s时吸光值，分别记为A1和A2。△A测定管=A1-A2。
计算公式：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按照蛋白浓度计算
活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。
ADH (nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反总×109)÷(Cpr×V样)÷T
=1608×△A ÷Cpr
（2）按照样本质量计算
活性单位定义：25℃中每克组织每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。
ADH (nmol/min/g 鲜重) =(△A÷ε÷d×V反总×109)÷(W×V样÷V样总)÷T
=1608×△A ÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：25℃中每104个细胞每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。
ADH (nmol/min/104cell) = (△A÷ε÷d×V反总×109) ÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T
=1608×△A ÷细胞数量
（4）按液体体积计算
活性单位定义：25℃中每毫升血清每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。
ADH (nmol/min/mL) =(△A÷ε÷d×V反总×109) ÷V样÷T
=1608×△A
ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10-4 L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；V样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间，1min。
b.使用96孔板测定的计算公式如下
（1）按照蛋白浓度计算
活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。
ADH (nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反总×109) ÷(Cpr×V样)÷T
=3215×△A÷Cpr
（2）按照样本质量计算
活性单位定义：25℃中每克组织每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。
ADH (nmol/min/g 鲜重) =(△A÷ε÷d×V反总×109) ÷(W×V样÷V样总)÷T
=3215×△A÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：25℃中每104个细胞每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。
ADH (nmol/min/104cell) =(△A÷ε÷d×V反总×109) ÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T
=3215×△A÷细胞数量
（4）按液体体积计算
活性单位定义：25℃中每毫升血清每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。
ADH (nmol/min/mL) =(△A÷ε÷d×V反总×109) ÷V样÷T
=3215×△A
ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5 cm；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10-4 L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；V样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间，1min。
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资料/datasheet
