用途
该试剂盒用于体外定量检测血清、血浆或其他相关生物液体中浓度。
检测原理
本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的抗原会与包被抗体结合，游离的成分被洗去。依次加入生物素化的抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。抗体与结合在包被抗体上的抗原结合、生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，抗原浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中指标的浓度。
| 反应类型 |
夹心法 |
| 规格 |
96T |
| 反应时间 |
4.5h |
| 反应性 |
通用 |
| 检测方法 |
Colormetric |
| 灵敏度 |
检测下线除以10 |
| 样本体积 |
100μL |
| 样本类型 |
血清、血浆或其他相关生物液体 |
| 特异性 |
可检测样本中的指标,且与其它相关蛋白无明显交叉反应 |
| 重复性 |
板内，板间变异系数均<10% |
样品活化方法
生物样品中的通常以无活性的形式存在，在检测指标活性前必须进行活化处理。
活化方法如下：
血清、血浆： 280 μL标准品&样品稀释液中加入40 μL样品，混匀，加入40 μL活化试剂1，室温孵育10分钟。再加入40 μL活化试剂2，混匀后立即检测。
注意：样品被稀释了
10倍！
细胞培养上清：20 μL标准品&样品稀释液中加入100 μL样品，混匀，加入40 μL活化试剂1，室温孵育10分钟。再加入40 μL活化试剂2，混匀后立即检测。
注意：样品被稀释了
2倍！
组织匀浆：1960 μL标准品&样品稀释液中加入40 μL样品，混匀后检测。
注意：样品被稀释了
50倍！
精密度
板内精密度:低浓度样本,中浓度样本和高浓度样本分别在1块板子上检测20次。板间精密度:低浓度样本,中浓度样本和高浓度样本分别在3块板子上检测20次。
| |
批内变异系数 |
批间变异系数 |
| 样本 |
1 |
2 |
3 |
1 |
2 |
3 |
| 数量 |
20 |
20 |
20 |
20 |
20 |
20 |
| 平均值( MERGEFIELD 单位ng/mL) |
0.41 |
1.07 |
4.96 |
0.47 |
1.25 |
4.24 |
| 标准差 |
0.02 |
0.05 |
0.22 |
0.03 |
0.06 |
0.2 |
| 变异系数 (%) |
4.88 |
4.67 |
4.43 |
6.38 |
4.8 |
4.72 |
回收率
分别往5个不同样本中添加已知浓度的目标蛋白，做回收实验，得出回收率范围和平均回收率。
| 样本类型 |
回收率范围 (%) |
平均回收率 (%) |
| 血清(n=5) |
94-110 |
102 |
| 血浆(EDTA)(n=5) |
90-102 |
96 |
| 细胞上清(n=5) |
95-106 |
98 |
线性
分别往5个样本中添加已知浓度的目标蛋白，做回收实验，得出回收率范围及平均回收率。将5个样本分别稀释2倍，4倍，8倍，16倍做回收实验，得出回收率范围及平均回收率。
| |
|
血清(n=5) |
血浆(EDTA)(n=5) |
细胞上清(n=5) |
| 1:2 |
回收率范围(%) |
99-108 |
95-105 |
92-104 |
| 平均回收率(%) |
105 |
102 |
97 |
| 1:4 |
回收率范围(%) |
95-109 |
90-100 |
97-105 |
| 平均回收率(%) |
102 |
96 |
100 |
| 1:8 |
回收率范围(%) |
89-103 |
89-104 |
96-108 |
| 平均回收率(%) |
97 |
97 |
102 |
| 1:16 |
回收率范围(%) |
88-102 |
98-108 |
92-105 |
| 平均回收率(%) |
94 |
104 |
100 |
试剂盒组成及保存
未拆封的试剂盒可在4℃保存一周；如果一周以后才使用试剂盒，请拆开试剂盒按照下表中的条件分别保存各组分。
| 试剂盒组成 |
48孔配置 |
96孔配置 |
| 说明书 |
1份 |
1份 |
| 封板膜 |
2片 |
2片 |
| 密封袋 |
1个 |
1个 |
| 酶标包被板 |
1×48 |
1×96 |
| 标准品 |
0.3ml×6管 |
0.3ml×6管 |
| 酶标试剂 |
5 ml×1瓶 |
10 ml×1瓶 |
| 样品稀释液 |
3 ml×1瓶 |
6 ml×1瓶 |
| 显色剂A液 |
3 ml×1瓶 |
6 ml×1瓶 |
| 显色剂B液 |
3 ml×1瓶 |
6 ml×1瓶 |
| 终止液 |
3 ml×1瓶 |
6 ml×1瓶 |
| 20×浓缩洗涤液 |
15ml×1瓶 |
25ml×1瓶 |
| 试剂盒组成 |
48孔配置 |
96孔配置 |
| 说明书 |
1份 |
1份 |
| 封板膜 |
2片 |
2片 |
| 密封袋 |
1个 |
1个 |
说明：所有试剂瓶盖须旋紧以防止蒸发和微生物的污染。
试剂体积以实际发货版说明书为准。相关试剂在分装时会比标签上标明的体积稍多一些，请在使用时量取而非直接倒出。
操作步骤
1. 标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；。
2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3. 加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。
4. 温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。
5. 配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。
6. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
7. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.
8. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
9. 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。
试验所需自备物品
1. 酶标仪(450nm波长滤光片)
2. 高精度移液器，EP管及一次性吸头：0.5-10 μL, 2-20 μL, 20-200 μL, 200-1000 μL
3. 37℃恒温箱，双蒸水或去离子水
4. 吸水纸
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资料/datasheet
