蛋白提取：
1、蛋白裂解液与裂解环境：对于普通蛋白的提取，如实验时间无特殊，选用普通的蛋白裂解液、冰上裂解即可；对于极易受环境影响的蛋白（比如低氧相关蛋白，HIF-1等），研究报道将细胞从低氧培养箱中取出2-3min即可影响HIF-1表达，因此宜选用超强效蛋白裂解液，并在低氧培养箱（37℃）中快速裂解。
2、组织蛋白提取：在组织蛋白提取过程中，一般推荐加用蛋白裂解液（磷酸酶和蛋白酶抑制剂）后，冰上研磨、匀浆化处理组织。组织来源不同，蛋白的产出亦不相同。
蛋白定量：
蛋白定量的方法有很多种，应用较多的主要有两种：BCA蛋白定量检测法和Bradford蛋白定量检测法，市售的蛋白定量试剂盒也多基于上述两种检测方法而开发的。两种方法均需配制蛋白标准品，蛋白与定量试剂经过一定时间的反应（BCA法反应为37℃、20-30min，Bradford法反应一般为37℃，5min），酶标仪读取样品的OD值，绘制的蛋白标准曲线，依据标准曲线计算WB蛋白的浓度。
下面介绍组织或细胞的蛋白提取和蛋白定量常规流程：
一、蛋白提取：
1.组织总蛋白提取
1、准备好所需要数量的样本管；放入研磨珠，置于冰盒上备用；
2、组织块先用预冷 PBS洗涤 2-3 次，除去血污，然后放在滤纸上，吸尽多余的 PBS 后放入对应的匀浆管中，加入大约 10 倍样本体积的完全裂解液，置于组织研磨仪中，对称放置，确认放置平衡后，盖好盖子，选择程序开始匀浆。
提示：
①、芝麻大小的组织，一般加入100-200μL 完全裂解液；绿豆大小组织加入 400-600μL 完全裂解液；黄豆大小组织加入 800-1000μL完全裂解液。
②、Servicebio三维研磨仪参考参数：2mm 氧化锆珠 8-12颗，频率6.5m/s，时间30s。如果一次匀浆不彻底，可以再次匀浆）。如果组织块比较大，可提前用剪刀将组织块剪碎。
2. 悬浮细胞提取蛋白
1、将细胞连带培养基一起吸入 15mL 离心管（EP-1501-J）中，4℃，2000rpm，离心 5分钟，去掉上清；
2、加入 1mL PBS 溶液（G4202-500ML）重悬细胞，将细胞转移到 1.5mL 离心管（EP-150-M）中，然后 4℃，2000rpm，离心 5分钟，去掉上清，保留沉淀，重复此步骤 2-3 次（此步骤目的为清洗细胞中残留的培养基）；
3、根据细胞沉淀的量加入适量的完全裂解液，例如沉淀体积为绿豆大小（大概 10uL 左右）的加入大约 200μL 完全裂解液，加入适量研磨珠，放入研磨仪进行裂解；
4、裂解完成后，12000rpm，4℃，离心 10分钟，上清即为总蛋白溶液。
3. 贴壁细胞提取蛋白
1、倒掉培养基，沿细胞培养皿侧壁或者培养瓶瓶口慢慢加入 PBS 溶液，轻轻晃动平皿或者培养瓶，然后将细胞培养皿/瓶倾斜放置，用移液枪轻轻吸除残余液体，尽量轻柔，不要将细胞冲掉，清洗 2-3 次，最后一次将残余 PBS 完全吸干；
2、加入适当体积的完全裂解液（例如六孔板各单孔细胞长满的话，加入大约 250μL完全裂解液），反复晃动细胞培养皿/瓶，让裂解液与细胞完全接触，用细胞刮刀将细胞刮下来，收集后，加入研磨珠，放入研磨仪中进行裂解；
3、裂解完成后，12000rpm，4℃，离心 10分钟，上清即为总蛋白溶液。
二、蛋白定量:
取适量上述步骤中未变性的总蛋白溶液，用 BCA 蛋白定量检测试剂盒（G2026-200T；G2026-1000T）测蛋白浓度，蛋白浓度测定方法如下：
A.配制蛋白标准贮备液
取1 mL蛋白标准配制液加入到蛋白标准品（BSA）蛋白标准管中，将25 mg蛋白标准品完全溶解，即得到浓度为25 mg/mL的蛋白标准贮备液。配制成的蛋白标准溶液可-20℃长期保存。
B.配制蛋白标准工作液
取适量25 mg/mL蛋白标准贮备液，用PBS或生理盐水稀释50倍，得到终浓度为0.5 mg/mL的蛋白标准工作液。注意稀释时按照10倍梯度方法稀释，确保稀释准确。
C.绘制标准曲线（酶标仪法）
将蛋白标准工作液分别按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96孔板中，然后用PBS或生理盐水依次加20、19、18、16、12、8、4、0 μL将上述梯度工作液补足到20 μL。得到蛋白浓度依次为0、25、50、100、200、300、400、500 μg/mL的梯度曲线。
D.准备待测样品
将待测的蛋白样品进行适当稀释（可通过预实验检测，使样品蛋白浓度在标准曲线范围内，确保检测结果可信），按照每个样品20 μL的量加到96孔板中。待测样品与蛋白标准品用相同溶液稀释。
E.配制BCA显色工作液
将BCA试剂与硫酸铜溶液按照50:1体积比充分混合均匀，得到BCA显色工作液。BCA显色工作液可室温保存，24 h内使用。每个待测样品需200 μL，建议按需配制，避免浪费。
F.检测
向标准曲线样品孔及待测样品孔中每孔加入BCA显色工作液200 μL，充分混匀（可将96孔板放在振荡器上振荡30 s），37℃反应30 min后，以标准曲线0号做参比，在562 nm波长下比色测定，记录各孔吸光度值。（注：也可以在室温反应2 h，或60℃反应30 min。如果蛋白浓度较低，建议置于60℃反应）
G.计算
以标准曲线中梯度蛋白含量（μg/mL）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线。根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应孔中待测样品的蛋白浓度（μg/mL），再乘以样品稀释倍数即为待测样品实际蛋白浓度。
提示：
1. BCA法测定蛋白浓度受温度和时间的影响较大，吸光度值会随着时间的延长或温度升高而变化，如果不能精确控制显色反应的时间和温度，建议每次测定都需要做标准曲线。
2. 在进行蛋白标准贮备液的配制时，需确保溶解充分。稀释配制蛋白标准工作液时建议10倍梯度稀释，不要一次稀释50倍，以免产生较大误差。
3. 为保证蛋白的精确定量，样品的提取和蛋白标准品的稀释配制最好选用相同的缓冲液，同保证两者检测条件一致。如果缓冲液本身就有较高的背景值，建议使用其他的方法测定。
4. 操作时请穿实验服，并佩戴一次性手套。
