阈值循环数 Threshold cycle (Ct) 也写作Cq值，荧光信号大于荧光阈值时PCR循环数。仪器软件通常将第3-15个循环的荧光值设为基线（baseline），是由于测量的偶然误差引起的。阈值（threshold）一般是基线的标准偏差的10倍。在实际操作中也可以手动调节。高于阈值的荧光信号被认为是真实的信号，用于定义Ct值。Ct会受到阈值的影响，每次试验由于样品和仪器的不同会导致基线不同，进而影响阈值和Ct值。

模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在一定线性关系,起始模板量浓度越高，Ct值越小；起始模板量浓度越低，Ct值越大。PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，Ct值的重现性较好，即相同含量的初始模板，得到的Ct值是相对稳定的。

Ct值不是恒定不变的，可以受到不同样品、不同仪器的影响，即使相同的样品在相同的仪器上重复2遍，Ct值也会存在差异。

为什么要有Ct值？

➤ 模板量与Ct值的关系：

在PCR指数扩增过程当中，产物量与循环数之间的关系是：扩增产物量=起始模板量×（1+En）循环个数。

➤ Ct值的设定：

qPCR扩增产物量是以荧光信号的形式直接呈现，也就是扩增曲线。在扩增过程当中，设定一个荧光信号值，当扩增产物量达到“一定产物量”时（即达到此荧光阈值时），此时循环数定义为Ct值，需要注意的是，Ct值需要处于指数扩增时期。因此Ct值与起始模板量的关系：模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。起始模板量浓度越高，Ct值越小；起始模板量浓度越低，Ct值越大。

➤ Ct值的重现性

Ct值是荧光定量PCR最重要的结果呈现形式，用于基因表达量差异或基因拷贝数的结果计算。一般情况下，复孔Ct值的差值最好不超过0.05，不然表明误差结果太大，结果不可信。在PCR早期，扩增处于理想情况下，循环数较少，产物积累少，产生荧光的水平不能与荧光本底背景明显的区别；之后荧光的产生增加进入指数期，此时微小误差尚未放大，Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。

1、与Ct值有关的参数

标准曲线Standard curve：模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。

相关系数Correlation coefficient (R^2) ：反映了标准曲线的线性，通常要求>0.99。

扩增效率Efficiency (E):通常要求在90%~110%。效率低于100%，是由于PCR反应中存在抑制因素；而高于100%可能一些污染、非特异性扩增或者是引物二聚体造成。

斜率Slope ：当扩增效率为100%时斜率为-3.32，当90%-110%时的斜率为-3.58 ~ -3.10。

2、Ct值与模板拷贝数的关系

理想情况下，qPCR的模板经过一定的循环数进行指数扩增，扩增循环数和产物量之间的关系是：扩增产物量Cn=起始模板量C1×（1+扩增效率E）^循环数n。但是由于E通常无法达到100%，并且在扩增的后期，扩增效率会逐渐降低，只有在理想的情况下才满足Cn=C1×2^n，即Ct值差1，初始浓度差2倍。

由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定。这是目前的qPCR定量的方法，即用已知浓度的标准品与未知浓度样品同时扩增，将未知浓度样品的Ct值代入该标准曲线获得未知样品浓度。分析定量时，一般取Ct:15-35。太大或者太小都会导致定量结果的不准确。标准曲线需满足：E：90%~110%，R^2≥0.99，斜率-3.58 ~ -3.10。同时定量标准品的量值需要准确可靠。用qPCR进行定量，理论上可行，实际上很难获得准确的定量结果。

3、Ct值异常的原因与解决方案