细胞的体外培养需要理想的气体环境，氧气、二氧化碳是细胞生存的必要条件。氧气参与细胞的三羧酸循环，为细胞生存、代谢与合成提供能量；二氧化碳既是细胞的代谢产物，是细胞生长的必需成分，又与维持培养液的pH有关。大多数细胞适宜的pH范围往往是7.2～7.4。在开放式培养中，以5%的二氧化碳气体比例为宜。 二氧化碳不仅是细胞生长的必需成分，还与维持培养液的pH有关。

      凡混入细胞培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应视为污染，细胞污染不能完全被消除，但能减少其发生的频率和后果的严重性。

下面介绍几种常见的细胞污染类型及处理方法。

一、常见污染类型：

细菌污染：

特征：大小在0.5~5 μm，比动物细胞小很多。多呈球状或杆状，形态规则，分布均匀；增殖速度快，一般污染后48~72小时爆发式增殖；营养消耗快，培养基很快变黄，变浑浊；镜下观察有明显的定向运动。

处理方法：轻度污染可用10X双抗清洗处理，重度污染建议消杀后丢弃。

真菌污染：

特征：呈链球状或丝状。常形成肉眼可见的菌落，培养基颜色无变化或变紫，仅对局部细胞影响较大，其他地方生长正常。会形成孢子，容易污染其他细胞。

处理方法：真菌污染较难根除，不建议保留，建议消杀后丢弃。

支原体污染：

特征：最小的微生物，无法通过光学显微镜看见，但可通过电镜观察到。感染支原体的细胞，在某一时间点碎片突然增多，随着传代，细胞状态显著变差。支原体污染可通过气溶胶传播，影响同一细胞房其他细胞。

鉴定方法：PCR法、显色法、荧光染色法等。

处理方法：若细胞状态尚可，添加支原体抑制剂培养2-3代可转阴；若细胞状态很差，建议消杀后丢弃。

黑胶虫污染：

特征：无明确定义，镜下无法直接观察到。主要表现为细胞状态差，黑点和碎片多，布朗运动。通过检测发现主要为支原体污染，部分为未知的增殖不明显的微生物污染。

处理方式：若细胞状态尚可，添加黑胶虫/支原体抑制剂培养2-3代可转阴；若细胞状态很差，建议消杀后丢弃。

细胞交叉污染

特征：即不同的细胞混杂在一起

二、鉴定方法：

同种属：STR鉴定，多等位基因数大于3个。

（需考虑本身的遗传背景，如EA.hy 926为融合细胞，本身就包含两套遗传信息）

不同种属：PCR法，对种属特异性基因进行扩增，不同种属产物大小不同。

处理方法：建议重新引种。

三、细胞污染后的处置：

细胞一旦发现有污染出现，应及时对所用试剂和耗材进行清理。耗材可更换新的或者重新高压灭菌，试剂可重新过滤除菌或者更换新批次，操作台和细胞房需用消毒液进行全面清洁消杀后方可复苏新的细胞，以免反复出现污染。

四、细胞污染的预防：　

①实验用品防止污染。细胞培养所用试剂、耗材、器材的清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌要仔细，并在无菌实验检测阴性后才能使用。操作室及剩余的无菌器材要定期清洁、消毒、灭菌。
②操作过程防止污染。
③穿着容易起静电或吸附灰尘的衣物必须更换为白大褂后才能进入细胞间。
④实验开始前需要确定戴的手套没有问题，只要接触过生物安全柜之外的物品，必须及时对手套进行消毒。
⑤不要从敞开的容器口上方经过，以避免衣服上掉落不明物体对细胞的污染。
⑥细胞操作时动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口放在火焰周围简单转动烧灼，注意不要让火焰把塑料瓶口烧化。
⑦瓶盖应当倒放在远离自己的地方，以避免瓶盖被误操作所污染。