酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种基于多孔板的技术，用于确定生物样品中的抗体、抗原或其他蛋白质的浓度，使用发色、荧光或发光的读数。自20世纪60年代开发以来，它们已成为许多诊断和生物医学研究实验室的主力军，在一系列应用中表现出特异性、灵敏度和可重复性。常见的例子包括各种传染病的检测和妊娠试验。使用ELISA有很多优点，但必须适当设置和优化，以确保结果可靠。本指南强调确保ELISA实验成功的技巧。免疫检测法的精确性表现为单次实验孔间（批内）的重复性和多次实验之间（批间）的重复性。CV值高则表明精确度低，通常由以下两个原因造成：移液技术和洗涤技术。

一、提前规划
    提前规划可以帮助工作流程有效运行，并减少错误和重测的可能性；因此，有必要在工作流程开始前彻底规划工作流程的所有组成部分。流程图和检测设计是重要的规划考虑因素。需要确定的因素包括：待测样品的数量、复测次数和所需的试剂平板/试剂盒的数量。
ELISA样品的复测是很重要的，因为这将突出异常的结果。为提高可靠性，最好使用三份样本，但必要时也可使用重复样本。方案中还需要考虑到质控，因为这将表明检测是否成功，是否保持在动态范围内，并能进行检测间的比较和校正。使用流程图来计划你的ELISA检测也将有助于减少任何样品位置的错误。
     当使用不同的试剂在多个平板或多个检测上进行时，所有的平板都需要有明确的标签和试剂的隔离，以避免混淆。此外，所有的试剂必须彻底解冻（如果需要的话），在使用前进行混合并注明日期，并检查任何光敏试剂是否变质。
另一个需要考虑的因素，特别是对于夹心法来说，就是一抗和二抗所来自的物种。当使用抗体对时，必须对它们进行测试以找到最理想的信号，并尽量减少任何交叉反应。
    许多市面上的试剂盒提供了抗体，然而，如果一个项目涉及到一个新的目标，那么针对已知和未知的样品测试一系列的抗体是很重要的。在优化检测时，尝试不同的抗体稀释度以提高检测的灵敏度，同时尽量减少交叉反应和背景噪音。尝试一系列的样品稀释度也可以帮助这个过程。
     封闭是工作流程的另一个关键部分，它能减少背景信号并将假阳性结果降至最低。一个好的封闭缓冲液将减少非特异性结合，同时不与（或只与最小的）所用的抗原、抗体或检测试剂发生反应。
封闭缓冲剂通常是蛋白质或非离子型洗涤剂，所用的类型取决于几个因素，包括所用的抗体、抗原和洗涤剂试剂以及平板的表面化学性质。
     最常见的封闭剂类型，牛血清白蛋白（BSA），是一种蛋白质。如果你的背景信号很高，你怀疑封闭不足，使用更高浓度的封闭剂或增加封闭时间可能有帮助。相反，如果你有一个持续的背景问题，可能值得投入时间来优化你所使用的封闭剂类型。

二、样品处理和移液技术
    试剂和样品处理不当或储存不正确会影响下游分析，因为不同的缓冲剂和试剂会有不同的储存要求。例如，有些必须储存在冰箱里，有些在室温下，有些用感光罩（如铝箔）。
如果有计划在未来的实验中使用相同的样品，那么应该把它们放入等分试样中，需要时再取出来。这将避免多次冷冻/解冻循环，保持准确的结果。当样品准备使用时，应在冰上解冻（或根据方案）。移液技术注意事项要点如下：
1. 移液时，枪头应对准孔，避免接触孔壁及底部。
2. 移液后轻轻晃动混匀试剂。
3. 如果您的样品具有黏性，请预先润洗枪头以消除表面张力的影响。吸液时等待片刻使体积平衡后再取出。
4. 移液不充分或移液体积不均，说明移液器需要校正。必要时请检查移液器并重新校正。
5. 加样时，不同的试剂标准品和样本间都要确保更换枪头，避免交叉污染。
6. 确保使用合适的枪头。不合适的枪头无法正确量取吸液和加样的体积。

                                              移液工作站
三、确保一致性和准确性
    获得一致和准确结果的方法之一是确保实验台被适当地设置，使所有的组件和仪器都触手可及。使用经过校准的精密移液器也将限制移液过程中的任何不一致。
运行内精密度是指各孔之间的误差。如前所述，加入重复样本对识别错误和异常情况很重要。变异系数（CV）是一个描述群体内变异性的比率，与观察值的绝对值无关。当解释ELISA的数据时，%CV对于识别样品复制中的任何不一致是很有用的。这表现在测定后的光密度（OD）值之间的变化。总之，%CV越低，结果越精确。
检测间的精确性是指板间或检测间的重复性，如在不同的日子完成的检测。尽管商业化的ELISA试剂盒有测定间质量控制，但科学家们必须保留一个详细的笔记本，记录在方案中任何时候的变化，以便其他研究人员能够以同样的方式完成同样的实验，获得同样的结果。这也使得检测能够随着时间的推移进行监测，以确定任何系统性问题或检测性能的下降。

四、避免污染
污染会在ELISA数据的下游分析中造成许多问题，如孔与孔之间的高差异、高背景值和弱或低信号强度。有几种方法可以防止污染：
1.在一个干净的环境中工作；
2.通过去离子或蒸馏对所有的水进行消毒；
3.每次转移时使用新的和干净的试剂；
4.在两个样品之间使用新的移液器吸头；
5.准备和应用样品时要小心，避免溅到或交叉污染；
6.如果使用自动化，确保系统被清洁，试剂供应经常更新；
7.只去除试剂需要的部分，避免将其倒回库存瓶中，因为这可能会引入污染物。

五、正确的洗板技术
正确的洗涤和冲洗方案尤其重要。在下游分析过程中，不充分、不一致和/或过度清洗会造成问题。有许多洗板的方法，包括使用自动洗板机、手动分流器或洗瓶。当手动吸出孔中的液体时，要注意不要碰到孔的底部--吸管的尖端应该放在孔的一侧。为了减少背景信号，清洗量需要足够大，以去除孔中未结合的样品和试剂。然而，过度洗涤会减少目标信号。
确保所有的孔都被平均清洗，以避免在整个检测板上引入信号变化。要做到这一点，如果是手工清洗，请检查移液器吸头是否固定好，如果使用自动洗板机，所有分配和吸液的喷头必须没有堵塞。你可以在空板上测试它们，以检查它们是否同样工作。
1. 如果使用自动洗板机或多通道移液器，请确保进出口能正常运作。
2. 最后一次洗涤后，翻转酶标板倒出多余的洗涤液，并在吸水纸上拍干液体。洗板太快或太慢都会降低精确度。不能让孔内液体自然风干，需立即进行下一步操作。
3. 按照说明书，添加足量的洗涤液至孔内，并保证洗涤完全。
4. 由于洗涤液不是通用的，当试剂盒内的洗涤液用完时，请不要使用其他试剂盒中的洗涤液。如有需要，可联系技术支持寻求帮助。
5. 不要减少洗涤时的浸泡时间或跳过浸泡的步骤。
6. 按照说明书上的洗涤次数清洗，随意改变洗涤的次数会影响实验的精确性。

六、数据归一化
    准确的数据分析是ELISA工作流程中非常重要的一步，它解决了测定间的变异性问题，这可能受到许多因素的影响，如温度和发育。为了限制这些因素对检测结果的影响，应在实验之间通过比较每个板上的标准品来进行归一化。

七、保持在动态范围内
    至关重要的是，检测样品要保持在板式读数器的动态范围内，否则结果将不具代表性，仪器的动态范围可以在机器手册中找到。在开发检测方法和确定样品稀释度时，最高和最低的阳性样品都应落在仪器的动态范围内。标准品通常与ELISA试剂盒一起提供；然而，这些也可以独立采购。
总的来说，ELISA是许多实验室的一个重要组成部分。遵循上面的提示将帮助任何人产生准确和可靠的结果。